Standardization of a rapid quadruplex PCR method for the simultaneous detection of bovine, buffalo, Salmonella spp, and Listeria monocytogenes DNA in milk / [Padronização de um método rápido de PCR quadriplex para a detecção simultânea de DNA de bovino, bubalino, Salmonella spp. e Listeria monocytogenes em leite]

The objective of the present study was to Standardize a Polymerase Chain Reaction (PCR) protocol for the authentication of bovine and buffalo milk, and to detect the presence of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes. For this, the target DNA was extracted, mixed, and subjected to a PCR assay. Milk samples were defrauded and experimentally contaminated with microorganisms to assess the detection of target DNA at different times of cultivation, bacterial titers, and concentration of genetic material. In addition, the protocol was tested with DNA extracted directly from food, without a pre-enrichment step. The proposed quadruplex PCR showed good accuracy in identifying target DNA sequences. It was possible to simultaneously identify all DNA sequences at the time of inoculation (0h), when the samples were contaminated with 2 CFU/250mL and with 6h of culture when the initial inoculum was 1 CFU/250mL. It was also possible to directly detect DNA sequences from the food when it was inoculated with 3 CFU/mL bacteria. Thus, the proposed methodology showed satisfactory performance, optimization of the analysis time, and a potential for the detection of microorganisms at low titers, which can be used for the detection of fraud and contamination.

O objetivo do presente estudo foi padronizar um protocolo de reação em cadeia da polimerase (PCR) para a autenticação de leite bovino e bubalino e a detecção da presença de Salmonella spp. e Listeria monocytogenes. Para isso, o DNA-alvo foi extraído, misturado e submetido ao ensaio de PCR. Amostras de leite foram fraudadas e contaminadas experimentalmente com os micro-organismos, para se avaliar a detecção do DNA-alvo em diferentes tempos de cultivo, os títulos bacterianos e a concentração de material genético. Além disso, o protocolo foi testado com DNA extraído diretamente do alimento, sem a etapa de pré-enriquecimento. A PCR quadriplex proposta mostrou boa precisão na identificação de sequências de DNA-alvo. Foi possível identificar simultaneamente todas as sequências de DNA no momento da inoculação (0h), quando as amostras estavam contaminadas com 2 UFC/250mL, e com seis horas de cultura, quando o inóculo inicial foi de 1 UFC/250mL. Também foi possível detectar diretamente as sequências de DNA do alimento quando este foi inoculado com 3 UFC/mL de bactérias. Dessa forma, a metodologia proposta apresentou desempenho satisfatório, otimização do tempo de análise e potencial para detecção de micro-organismos em baixos títulos, podendo ser utilizada para detecção de fraude e contaminação.

Development of tetra-primer ARMS-PCR protocol to genotype the prolactin receptor SNP 39136666 and assessment of this SNP in Brazilian locally adapted cattle breeds / [Desenvolvimento de protocolo de tetra-primer ARMS- PCR para genotipagem do SNP 39136666 do receptor da prolactina e avaliação desse SNP em raças bovinas brasileiras localmente adaptadas]

As raças taurinas de origem ibérica Limonero e Carora (Bos primigenius taurus) possuem o fenótipo de pelo curto, liso e com baixa densidade folicular, o que confere a esses animais maior tolerância térmica e melhor produtividade em regiões quentes. Diferentes mutações associadas a esse fenótipo foram descritas no gene do receptor de prolactina PRLR, localizado no cromossomo bovino BTA20. Uma mutação recentemente encontrada é a substituição do nucleotídeo C por T, SNP 39136666 (p. R497*), no exon 11, que gera um códon de parada e, consequentemente, uma menor isoforma desse receptor. Neste trabalho, desenvolveu-se um protocolo rápido e de baixo custo para detecção desse SNP, utilizando-se a técnica de tetra-primer ARMS-PCR. Assim, foi possível detectar essa mutação nas raças brasileiras de origem ibérica localmente adaptadas: Caracu, Crioulo Lageano, Mocho Nacional e Pantaneiro. O alelo T foi mais frequente na raça Caracu (80%), enquanto o alelo C foi mais frequente na raça Crioulo Lageano (84%). Essa simples metodologia pode ser usada para genotipar esse SNP e ajudar na aplicação dessas informações moleculares em programas de melhoramento focados na tolerância térmica em bovinos taurinos e seus mestiços.(AU)

Detection of fraud by addition cow's milk in cheese buffalo and its connection with seasonality / Detecção de fraude por adição de leite de vaca em queijo de búfala e a relação com a sazonalidade

The seasons influence the production of buffalos’ milk. Because of this, the producers may produce a mixture of buffalo and bovine milk during cheese production in periods of low production. Therefore, the present work aimed to investigate fraud in buffalo cheese and the relationship between seasonality and different physicochemical properties of buffalo cheeses produced and marketed in eastern Amazonia. We obtained commercial samples of buffalo cheese during two Amazonian climatic periods from commercial points of Marajó-Pará, Brazil. After collection, there were lipid, protein, ash, and humidity analyses. Determination of carbohydrates and energy values was also performed for the nutritional characterization of samples, as well as for mPCR analysis to detect buffalo and/or bovine DNA. DNA extraction protocol of the samples was standardized and two pairs were used for the mPCR reaction, amplifying fragments of approximately 220 bp for Bubalus bubalis DNA and 346 bp fragments for Bos taurus DNA. Among the samples acquired in the rainy season, we observed that 33% were inadequately labeled, indicating fraud from cow’s milk incorporation and fraud from substitution of raw material. From the nine samples obtained in the dry season, all the samples showed cow’s milk incorporation fraud. The highest fraud rate coincided with the period of low milk production from buffalo and there was a difference in composition between fraudulent and non-fraudulent cheeses. Therefore, seasonality influences increase in cattle milk for the production of buffalo cheese, and this adulteration may decrease the nutritional content of the product.

As estações climáticas influenciam a produção de leite de búfala. Isso pode levar os produtores a misturarem os leites de búfala e bovino durante a produção de queijo em períodos de baixa produção. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo verificar fraudes em queijo de búfala, a relação com a sazonalidade e as diferenças físico-químicas de queijos de origem bubalina, produzidos e comercializados no leste da Amazônia. Foram coletadas amostras comerciais de queijo de búfala em dois períodos climáticos da Amazônia em pontos comerciais do Marajó-Pará, Brasil. Após a coleta foram realizadas análises de lipídios, proteínas, cinzas e umidade. A determinação dos carboidratos e do valor energético também foi feita para a caracterização nutricional das amostras, bem como a análise de mPCR para a detecção de DNA de búfalo e/ou bovino. Para isso, padronizou-se um protocolo de extração de DNA das amostras e utilizou-se dois pares na reação mPCR, amplificar fragmentos de aproximadamente 220 pb para o DNA de Bubalus bubalis e fragmentos de 346 pb para o Bos taurus. Entre as amostras adquiridas na estação chuvosa, observou-se que 33% foram rotuladas inadequadamente, caracterizando fraude por incorporação de leite de vaca e fraude por substituição de matéria-prima. Das 9 amostras coletadas no período seco, todas as amostras apresentaram fraude na incorporação do leite de vaca. Este estudo revelou que a maior taxa de fraude coincide com o período de baixa produção de leite e que há uma diferença na composição entre queijos fraudulentos e não fraudulentos. Portanto, a sazonalidade influencia no acréscimo de leite de bovinos na produção de queijo de búfala e que esta adulteração pode diminuir o conteúdo nutricional do produto.

Identification and characterization of Aspergillus fumigatus isolates from broilers / Identificação e caracterização de Aspergillus fumigatus isolados de frangos de corte

Aspergillosis is one of the main causes of mortality in birds. The pulmonary system is most frequently affected, with lesions observed in the air sacs and lungs of a wide variety of bird species. The aim of this study was to confirm by molecular methods the identification and the genetic diversity of Aspergillus fumigatus isolates of lung's samples from healthy broilers (Galus galus domesticus). Forty-four (9.5%) isolates of lung's samples were confirmed as A. fumigatus by polymerase chain reaction (PCR) multiplex (amplification of ß-tub and rodA gene fragments). Microsatellite typing for A. fumigatus was used to analyse all avian isolates. Among them, 40 genotypes (90.9%) were observed only one time. The results showed a high variability and multiple genotypes of de A. fumigatus collected from lung's samples of broilers.(AU)

Aspergilose é uma das principais causas de mortalidade em aves. O sistema pulmonar de uma grande variedade de espécies de aves é o mais frequentemente afetado, com lesões nos sacos aéreos e pulmões. Objetivou-se confirmar por métodos moleculares a identificação e a diversidade genética de Aspergillus fumigatus isolados de amostras pulmonares de frangos de corte sadios (Galus galus domesticus). Quarenta e quatro (9,5%) isolados foram confirmados como A. fumigatus através de reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex (amplificação de fragmentos dos genes ß-tub e rodA). Todos isolados foram tipificados, sendo quarenta (90,9%) observados apenas uma vez. Os resultados mostram uma alta variabilidade e múltiplos genótipos de A. fumigatus obtidos de amostras pulmonares de frangos, de corte.(AU)

Virulence profiles of enterotoxigenic Escherichia coli isolated from piglets with post-weaning diarrhea and classification according to fecal consistency / Perfis de virulência de Escherichia coli enterotoxigênica isoladas de leitões desmamados com diarreia do Sul do Brasil e classificação das amostras de acordo com a consistência fecal

The aim of this study was to assess the frequency and association of virulence factors of Escherichia (E.) coli isolated from weaned piglets with diarrhea and to correlate it with fecal consistency. A total of 152 rectal swabs were collected from 25-40 day-old piglets with diarrhea, in farms of Southern Brazil. Phenotypical and molecular techniques were used for bacterial isolation, characterization and classification of enterotoxigenic E. coli (ETEC) pathotypes. Statistical analysis was carried out to determine the frequency of virulence factors and virotypes, of fimbriae F4, F5, F6, F18, F41 and toxins LT, STa, STb and STx2e. Out of 456 E. coli isolates, 287 (62.9%) samples showed significant growth of E. coli. Among them, 194 (67.6%) samples showed at least one virulence factor, indicating that ETEC is an important etiological agent of diarrhea in weaned piglets. Higher frequencies were found of fimbria F4 and F18 and enterotoxins LT, STa and STb. Significant association was found to F4, LT, STa and STb; between F18 and STa and STx2e; between F5 and LT, STa and STb. The most frequent virotypes were F18-STa, F4-LT-STa-STb, F4-STa, F4-LT-STb and F18-STa-STx2e. Beta-hemolysis was observed in 47.4% of samples and there was significant association between hemolytic samples and virulence factors F4, F18, STa and STx2e. Regarding fecal consistency, there was significant association of liquid feces and F4 fimbria, STa toxin and virotypes F4-STa and F4-F5-LT-STa-STb. Since there was significant association of ETEC and liquid feces in nursery piglets, it is important to prioritize the sampling of liquid feces for the diagnosis etiologic cause of diarrhea.

O objetivo deste estudo foi avaliar a frequência e associação de fatores de virulência de Escherichia (E.) coli isoladas de leitões desmamados com diarreia e correlacioná-la com consistência fecal. Suabes retais foram coletados em leitões com 25-40 dias de idade com sinal clínico de diarreia, em granjas do Sul do Brasil, totalizando 456 amostras. Foram utilizadas técnicas fenotípicas e moleculares para isolamento bacteriano, caracterização e classificação de patotipos de E. coli enterotoxigênica (ETEC). A análise estatística foi realizada para determinar a frequência de fatores de virulência e virotipos, de fímbrias F4, F5, F6, F18, F41 e toxinas LT, STa, STB e STx2e. Duzentas e oitenta e sete (62,9%) amostras apresentaram crescimento significativo de E. coli. Entre os quais, 194 (67,6%) amostras apresentaram pelo menos um fator de virulência, indicando que ETEC é um importante agente etiológico de diarreia em leitões desmamados. As frequências mais elevadas foram encontradas para as fímbrias F4 e F18 e enterotoxinas LT, STa e STb. Associação significativa foi encontrada para F4, LT, STa e STb; entre F18 e STa e STx2e; entre F5 e LT, STa e STb. Os virotipos mais frequentes foram F18-STa, F4-LT-STa-STb, F4-STa, F4-LT-STb e F18-STa-STx2e. Beta-hemólise foi observada em 47,4% das amostras e houve associação significativa entre amostras hemolíticas e fatores de virulência F4, F18, STa e STx2e. Quanto consistência fecal, houve associação significativa de fezes líquidas e fímbria F4, toxina STa e virotipos F4-STa e F4-F5-LT-STa-STb. A associação significativa da ETEC e fezes líquidas em leitões de creche, é importante para priorizar a amostragem de fezes com essa consistência para no diagnóstico etiológico da diarreia.

Caracterização de estirpes de Campylobacter coli isoladas de carcaças de ovinos e de efluentes de abatedouro do estado de São Paulo / Characterization of Campylobacter coli strains isolated from the carcasses of sheep and of wastewater of abattoir in the state of São Paulo

Doença bacteriana zoonótica, a campilobacteriose é responsável mundialmente por frequentes casos de gastroenterite humana. Campylobacter spp. apresenta fator de virulência associado à diarreia, denominado toxina citoletal distensiva (CDT), sendo codificado pelos genes do complexo cdt. Os objetivos do presente estudo foram: 1) isolar e identificar estirpes de Campylobacter spp. de 102 suabes de carcaças e 102 suabes retais de ovinos (Ovis aries) e de sete amostras de água dos efluentes, antes e depois do tratamento de desinfecção de abatedouro localizado no estado de São Paulo; e 2) detectar, pela técnica de multiplex-PCR, a presença do complexo de genes cdt. Foram isoladas e identificadas, por métodos fenotípicos e genotípicos, sete estirpes de Campylobacter coli provenientes de 4/102 (3,92%) das amostras de suabes retais, 1/102 (0,98%) de suabes de carcaças e 2/7 (28,5%) das águas dos efluentes. Dos isolados de suabes retais, em 2/7 (28,6%) estirpes foi detectada a presença dos genes cdt. Trata-se do primeiro relato de isolamento de estirpes de Campylobacter coli provenientes de abatedouro de ovinos e das estirpes portadoras do complexo de genes cdt nessa espécie animal no Brasil.

A zoonosis and bacterial disease, campylobacteriosis is responsible for frequent cases of human gastroenteritis worldwide. Campylobacter spp. presents the virulence factor called cytolethal distensive toxine (CDT), responsible for diarrhea and codified by the cdt gene. The aims of this study were: 1) to isolate and identify Campylobacter spp. strains from 102 carcass swabs and 102 rectal swabs of sheep (Ovis aries) and seven samples of wastewater, before and after the disinfection treatment, collected from the abattoir of the state of São Paulo; and 2) to detect the presence of cdt gene complex by Multiplex-PCR in strains of Campylobacter spp. Seven strains of Campylobacter coli were isolated and identified by phenotypic and genotypic methods: 4/102 (3.92%) from rectal swabs, 1/102 (0.98%) from carcass swabs and 2/7 (28.5%) from wastewater. From the rectal swab samples 2/7 (28.6%) strains were detected with the cdt gene. This is the first report on the isolation of Campylobacter coli from sheep abattoir, and of strains carrying the cdt gene complex in this animal species in Brazil.

Gram-negative bacterium isolated from cardinals (Paroaria coronata and P. dominicana) seized from illegal wildlife trade / Bactérias gram-negativas em cardeais (Paroaria coronata e Paroaria dominicana) apreendidos do tráfico de animais silvestres

Illegal wildlife trade removes millions of birds from nature every year. Among the most trafficked species of birds are redcrested cardinals (Paroaria coronata) and red-cowled cardinals (Paroaria dominicana). The cloacal microbiota of free-living passerines consists mainly of gram-positive bacilli and cocci, and gram-negative bacilli predominate in captive birds. Under stress and low immunity, gram-negative species may cause opportunistic infections. This study identified bacteria from cloacal microbiota of 49 specimens of P. coronata and P. dominicana seized from illegal wildlife trade in São Paulo (SP). In this study, 13 species of gram-negative bacteria, including Salmonella spp. and Pseudomonas aeruginosa were isolated. An increased occurrence of Escherichia coli was identified in 42/49 (85.7 %) of fecal samples. Among the E. coli strains, 21/42 belonging to the phylogenetic groups B2 and D, were related to extraintestinal pathogenic strains causing disease in humans. Klebsiella pneumoniae were isolated in 28/49 (57.1 %) samples. These results reinforce the fact that stressful conditions of illegal trade can favor the colonization of cloacal microbiota of these birds by pathogens, which represents a risk for their reintroductioninto the wild, including the transmission of diseases to humans and other animals...

Anualmente o tráfico de animais silvestres retira milhões de aves da natureza. Os cardeais (Paroaria coronata) e cardeais-donordeste (Paroaria dominicana) estão incluídos entre as espécies de aves mais traficadas. A microbiota cloacal de passeriformes de vida livre é composta principalmente por bacilos e cocos gram-positivos, já os bacilos gram-negativos predominam em aves de cativeiro. Em situações de estresse e baixa de imunidade as bactérias gram-negativas podem causar infecções oportunistas. O presente trabalho identificou bactérias da microbiota da cloaca de 49 espécimes de P. coronata e P. dominicana apreendidas do tráfico de animais silvestres em São Paulo (SP). Foram isoladas treze espécies de bactérias gram-negativas, incluindo Salmonella spp. e Pseudomonas aeruginosa. A maior frequência de ocorrência foi de Escherichia coli, identificada em 42/49 (85,7%) das amostras fecais. Dentre os isolados de E. coli, 21/42 pertenciam aos grupos filogenéticos B2 e D, relacionados a estirpes patogênicas que causam doença extraintestinal em humanos. Klebsiella pneumoniae foi isolada em 28/49 (57,1%) das amostras. Esses resultados reforçam que as condições estressantes a que esses animais são submetidos em situações de tráfico, incluindo o contato com humanos, podem favorecer a colonização da microbiota cloacal das aves por patógenos, o que representa um risco para a sua reintrodução na natureza considerando-se o possível contato com humanos e outros animais...

Detection of virulence factors and antimicrobial resistance patterns in shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from sheep / Detecção de fatores de virulência e de resistência antimicrobiana em isolados produtores de toxina Shiga de ovinos

In order to detect virulence factors in Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) isolates and investigate the antimicrobial resistance profile, rectal swabs were collected from healthy sheep of the races Santa Inês and Dorper. Of the 115 E. coli isolates obtained, 78.3% (90/115) were characterized as STEC, of which 52.2% (47/90) carried stx1 gene, 33.3% (30/90) stx2 and 14.5% (13/90) both genes. In search of virulence factors, 47.7% and 32.2% of the isolates carried the genes saa and cnf1. According to the analysis of the antimicrobial resistance profile, 83.3% (75/90) were resistant to at least one of the antibiotics tested. In phylogenetic classification grouped 24.4% (22/90) in group D (pathogenic), 32.2% (29/90) in group B1 (commensal) and 43.3% (39/90) in group A (commensal). The presence of several virulence factors as well as the high number of multiresistant isolates found in this study support the statement that sheep are potential carriers of pathogens threatening public health...

A fim de detectar os fatores de virulência em isolados de E. coli produtoras de toxina Shiga (STEC) e investigar o perfil de resistência aos antimicrobianos, swabs retais foram coletados em ovelhas saudáveis das raças Santa Inês e Dorper. Dos 115 isolados de E. coli obtidos, 78,3% (90/115) foram caracterizados como STEC, dos quais 52,2% (47/90) possuíam o gene stx1, 33,3% (30/90) stx2 e 14,5% (13/90) ambos os genes. Em busca de fatores de virulência, 47,7% e 32,2% dos isolados apresentaram genes saa e cnf1. De acordo com a análise do perfil de resistência a antimicrobianos, 83,3% (75/90) eram resistentes a pelo menos um dos antibióticos testados. Na classificação filogenética, os isolados foram agrupados 24,4% (22/90) no grupo D (patogênico), 32,2% (29/90) no grupo B1 (comensal) e 43,3% (39/90) no grupo A (comensal). A presença de vários fatores de virulência, bem como o elevado número de isolados multirresistentes encontrados neste estudo apoia a afirmação de que as ovelhas são portadoras potenciais de patógenos que ameaçam a saúde pública...

Infecção por Corynebacterium pseudotuberculosis em equinos: aspectos microbiológicos, clínicos e preventivos / Corynebacterium pseudotuberculosis infection in horses: clinical, microbiological and prevention aspects

Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente causador da linfadenite caseosa em caprinos e ovinos, sendo responsável por significativas perdas econômicas na ovinocaprinocultura mundialmente. Esta bactéria Gram-positiva também infecta equinos, causando desde quadros assintomáticos até infecções sistêmicas, podendo levar o animal a óbito. Especificamente no Brasil, não foram relatados casos de infecção em equinos, mas acredita-se que, devido à convivência de pequenos ruminantes infectados com equinos em diversas propriedades rurais, seja natural que ocorra a infecção desses animais. A presente revisão tem como objetivo fornecer informações sobre a bactéria C. pseudotuberculosis, sobre os aspectos epidemiológicos e clínicos da infecção em equídeos, bem como sobre técnicas de manejo para sua prevenção...

Corynebacterium pseudotuberculosis is the etiologic agent of caseous lymphadenitis in sheep and goats, an infectious disease that is responsible for significant economic losses in small ruminants breeding units worldwide. This Gram-positive bacterium can infect horses, causing symptomatic disease to systemic infections, which can lead to animals' death. Specifically in Brazil, there are no scientific records of equine infections, but it is believed that, due to the maintenance of infected small ruminants in close association to horses in many properties, the infection of horses may be a reality. The present work had the objective to present information on the bacteria C. pseudotuberculosis, on the epidemiological and clinical aspects of the infection in horses, as well as information about breeding procedures that can be adopted in order to prevent the infection...

Detecção de resistência às fluoroquinolonas em Campylobacter isolados de frangos de criação orgânica / Detection of fluoroquinolone resistance in Campylobacter strains from organic poultry

Estudos têm revelado que a resistência às quinolonas em cepas de Campylobacter está relacionada à presença da mutação Treonina-86 para Isoleucina. Com o objetivo de investigar a presença dessa mutação em cepas de Campylobacter sensíveis e resistentes à ciprofloxacina e enrofloxacina, o conteúdo cecal de 80 frangos de corte de criação orgânica, abatidos sob Serviço de Inspeção Estadual (S.I.E.) do Estado do Rio de Janeiro, foram coletados e investigados para a presença de Campylobacter. A determinação da resistência à ciprofloxacina e enrofloxacina foi feita pela técnica de difusão em disco e de diluição em ágar para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). A detecção da mutação na Região Determinante de Resistencia às Quinolonas (RDRQ) no gene gyrA foi realizada através de sequenciamento. Campylobacter foi isolado a partir de 100% das amostras avaliadas, sendo 68,75% correspondente à C. jejuni e 31,25% à C. coli. No teste de difusão em disco, 100% das cepas foram resistentes à ciprofloxacina e 56,25% das cepas foram resistentes à enrofloxacina. No teste de diluição em ágar, todas as cepas foram resistentes à ciprofloxacina apresentando CIM variando de ≥ 16-64μg/mL, e resistência ou resistência intermediaria à enrofloxacina foi detectada em 42,50% (CIM ≥ 4-32μg/mL) e 38,75% (CIM = 2μg/mL) das cepas, respectivamente. A mutação Tre-86-Ile, foi observada em 100% das cepas analisadas. Além dessa mutação, foram observadas outras mutações não silenciosas (Val-73-Glu, Ser-114-Leu, Val-88-Asp, Ala-75-Asp, Ser-119-Gli, Arg-79-Lis) e mutações silenciosas (His-81-His, Ser-119-Ser, Ala-120-Ala, Fen-99-Fen, Ala-122-Ala, Gli-74-Gli, Ile-77-Ile, Ala-91-Ala, Leu-92-Leu, Val-93-Val, Ile-106-Ile, Tre-107-Tre, Gli-113-Gli, Ile-115-Ile, Gli-110-Gli). A observação de que cepas sensíveis à enrofloxacina pelos testes fenotípicos apresentavam a substituição Tre-86 para Ile sugere que outros mecanismos podem contribuir para a resistência à enrofloxacina em Campylobacter...

Studies have shown that resistance to quinolones in Campylobacter strains is related with Threonine-86-Isoleucine mutation. In order to investigate the presence of this mutation in sensitive and resistant Campylobacter strains to ciprofloxacin and enrofloxacin, the cecal contents of 80 broilers from organic raising chickens, slaughtered under State Inspection Service (S.I.S) of the State of Rio de Janeiro, were collected and tested for the presence of Campylobacter. The determination of ciprofloxacin and enrofloxacin susceptibility was done by disk diffusion and agar dilution methods for determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC). The detection of mutation in Quinolone Resistance Determinant Region (QRDR) in gyrA gene was done by sequencing. Campylobacter was isolated from 100% of the samples, being 68.75% C. jejuni and 31.25% C. coli. By the disk diffusion method, resistance to ciprofloxacin was observed in all isolates and 56.25% of the strains were resistant to enrofloxacin. By agar dilution method, all strains were resistant to ciprofloxacin (MIC ≥ 16μg/mL to ≥ 64μg/mL) and full and intermediate resistance to enrofloxacin was detected in 42.50% (MIC ≥ 4-32μg/mL) and 38.75% (MIC =2μg/mL) of the strains, respectively. Mutation Thr-86-Ile was observed in 100% of the isolates investigated. In addition to this mutation, others no silent mutations (Val-73-Glu, Ser-114-Leu, Val-88-Asp, Ala-75-Asp, Gly-119-Ser, Arg-79-Lys) and silent mutations (His-81-His, Ser-119-Ser, Ala-120-Ala, Phe-99-Phe, Ala-122-Ala, Gly-74-Gly, Ile-77-Ile, Ala-91-Ala, Leu-92-Leu, Val-93-Val, Ile-106-Ile, Thr-107-Thr, Gly-113-Gly, Ile-115-Ile, Gly-110-Gly) were detected. All the enrofloxacin-sensitive strains by the phenotypic methods had the Thr-86 to Ile substitution, which suggests other mechanisms contributing to enrofloxacin resistance in Campylobacter...

Resistance to B-lactam and tetracycline in Campylobacter spp isolated from broiler slaughterhouses in southern Brazil / Resistência a B-lactâmicos e tetraciclina em Campylobacter spp isolados de matadouros-frigoríficos de aves no sul do Brasil

The study was carried out to screen and analyze the genetic characteristics of antimicrobial resistance in Campylobacter spp. from poultry sources. A total of 141 strains of Campylobacter isolated from samples of broilers of slaughterhouses in southern Brazil was identified by phenotypic and genotypic methods. Campylobacter isolates were evaluated for its antimicrobial susceptibility and the presence of resistance genes. The strains were investigated for antimicrobial susceptibility against two agents (ampicillin and tetracycline) by disk diffusion method. PCR assay was used to confirm the specie and the presence of ampicillin (blaOXA-61), tetracycline tet(O), and the energy-dependent multi-drug efflux pump (cmeB) genes. Campylobacter jejuni was the most ubiquitous; its presence was determined in 140 samples out of 141 (99.3%), whereas Campylobacter coli was found only in one of the contaminated samples (0.70%). The results obtained showed 65% and 35.5% of Campylobacter isolates resistant to β-lactams and tetracyclines, respectively. The cmeB gene responsible for multidrug resistance was detected in 26 isolates out 141 strains (18.5%). Moreover, 36 out of 141 Campylobacter strains (25.6%) were found to be resistant to at least two different antimicrobia resistance markers (β-lactams and tetracyclines)...

O presente estudo foi realizado para examinar e analisar as características genéticas de resistência antimicrobiana de Campylobacter spp. a partir de fontes avícolas. Um total de 141 amostras de Campylobacter isolados em matadouros-frigoríficos de aves do estado do Rio Grande do Sul, Brasil, foi identificado por métodos fenotípicos e genotípicos. Foi analisada a susceptibilidade antimicrobiana e a presença de genes de resistência. As cepas foram testadas para detectar sensibilidade frente a dois antimicrobianos (ampicilina e tetraciclina) pelo método de difusão em disco. A seguir, usando a reação em cadeia da polimerase foi confirmada a espécie e a presença dos genes de resistência à ampicilina (blaOXA-61) e tetraciclina tet(O), assim como a detecção da bomba de efluxo (cmeB). Campylobacter jejuni foi a espécie mais isolada, sua presença foi determinada em 140 amostras (99,3%), e Campylobacter coli foi encontrada em uma única amostra (0,70%). Os resultados obtidos mostraram 65% e 35,5% de Campylobacter isolados resistentes a β-lactâmicos e tetraciclinas, respectivamente. O gene cmeB responsável pela resistência a múltiplos antimicrobianos foi detectado em 26 amostras (18,5%). Neste contexto, 36 das 141 amostras (25,6%) foram consideradas resistentes a dois grupos diferentes de antimicrobianos (β-lactâmicos e tetraciclinas)...

Evaluation of a PCR multiplex for detection and differentiation of Mycoplasma synoviae, M. gallisepticum, and M. gallisepticum strain F-vaccine / Avaliação de uma PCR multiplex para detecção e diferenciação de Mycoplasma synoviae, Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma gallisepticum cepa F vacinal

Mycoplasma gallisepticum (MG) and Mycoplasma synoviae (MS) are the mycoplasma infections of most concern for commercial poultry industry. MG infection is commonly designated as chronic respiratory disease (CRD) of chickens and infections sinusitis of turkeys. MS causes sub clinical upper respiratory infection and tenosynovitis or bursitis in chickens and turkeys. The multiplex PCR was standardized to detect simultaneously the MS, MG field strains and MG F-vaccine strain specific. The generic PCR for detection of any species of Mollicutes Class was performed and compared to the multiplex PCR and to PCR using species-specific primers. A total of 129 avian tracheal swabs were collected from broiler-breeders, layer hens and broilers in seven different farms and were examined by multiplex PCR methods. The system (multiplex PCR) demonstrated to be very rapid, sensitive, and specific. Therefore, the results showed a high prevalence of MS in the flocks examined (27.9%), and indicate that the MS is a recurrent pathogen in Brazilian commercial poultry flocks...

Mycoplasma gallisepticum (MG) and Mycoplasma synoviae (MS) são micoplasmas que causam infecção de maior preocupação para a indústria avícola. MG é a bactéria responsável pela infecção, comumente designada, como doença crônica respiratória (DCR) de galinhas e sinusite infecciosa de perus. MS é responsável por infecções subclínicas do trato respiratório superior e tenosinovite ou bursite em galinha e perus. A reação da PCR multiplex foi padronizada para detectar simultaneamente MS, MG cepa de campo e MG-F cepa vacinal. A PCR genérica para detecção de qualquer espécie de Mycoplasma foi realizada e comparada a PCR multiplex e a PCR com primers específicos. O total de 129 amostras de suabes de traqueia foi coletado de reprodutoras pesadas, poedeiras e frangos em sete diferentes empresas avícolas e então foram examinados por PCR multiplex. O sistema da PCR multiplex demonstrou ser muito rápido, sensível e específico. Então, os resultados mostraram uma alta prevalência de MS nos lotes examinados ( 27,9%), e indica que MS é um patógeno recorrente nos lotes de aves comerciais brasileiro...

Detection, quantification and genetic variability of Mycoplasma hyopneumoniae from apparently healthy and pneumonic swine / Detecção, quantificação e variabilidade genética de Mycoplasma hyopneumoniae a partir de suínos pneumônicos e aparentemente saudáveis

Molecular differences among Mycoplasma hyopneumoniae strains present in pneumonic lungs of swine have been largely studied. However, no comparative studies concerning the strains present in apparently healthy pigs have been carried out. This study aimed to detect, quantify and perform molecular analysis of M. hyopneumoniae strains in pig lungs with and without pneumonic lesions. The detection of M. hyopneumoniae was performed using multiplex PCR (YAMAGUTI, 2008), real-time PCR (STRAIT et al., 2008) and multiple VNTR amplification (VRANCKX et al., 2011). Molecular characterization of the strains was achieved by analysis of the VNTR copy number in P97R1, P146R3, H2R1 and H4. M. hyopneumoniae was detected in samples from healthy and pneumonic pigs and the amount of M. hyopneumoniae positive samples detected varied with the type of assay. The greater number of positive samples was identified by the multiple VNTR amplification combined with capillary electrophoresis. Using real-time PCR, 4.9*104 M. hyopneumoniae genome copies/mL was detected in apparently healthy lungs. A mean quantity of 3.9*106 M. hyopneumoniae genome copies/mL was detected in pneumonic lungs. The analysis of VNTR copy number demonstrated a high genetic variability of the M. hyopneumoniae strains present in apparently healthy and pneumonic lungs. Strains having 3 VNTR copy number in P97R1, were detected only in pneumonic lungs and strains having 40 and 43 VNTR copy number in P146R3 were detected only in apparently healthy lungs. Despite the genetic variability of M. hyopneumoniae, predominant strains in the swine farms could be identified...

As diferenças moleculares entre as estirpes de Mycoplasma hyopneumoniae presentes em pulmões de suínos com pneumonia tem sido estudadas. Porém, estudos comparativos relativos as estirpes presentes nos suínos aparentemente saudáveis não foram levados a cabo. O objetivo do estudo foi a detecção, quantificação e analise molecular de M. hyopneumoniae nos pulmões suínos com e sem lesões pneumônicas. Para a detecção de M. hyopneumoniae usaramse o PCR Multiplo (YAMAGUTI, 2008), o PCR a Tempo Real (STRAIT et al., 2008) e a amplificação de múltiplo VNTR (VRANCKX et al., 2011). A caracterização molecular das estirpes foi realizada mediante a análise do número de copias de VNTR em P97R1, P146R3, H2R1 e H4. O M. hyopneumoniae foi detectado em amostras de suínos saudáveis e pneumônicos e a quantidade de M. hyopneumoniae nas amostras positivas variou com o tipo de ensaio. O maior número de amostras positivas foi identificado pela amplificação de múltiplas VNTR combinado com a eletroforese de capilares. Usando o PCR a Tempo Real, 4.9*104 copias de genoma/mL de M. hyopneumoniae foram detectadas em pulmões aparentemente saudáveis. Uma quantidade média de 3.9*106 copias de genoma/mL de M. hyopneumoniae foi detectada em pulmões pneumônicos. A análise do número de copias de VNTR demonstrou uma elevada variabilidade...

A multiplex quantitative real-time polymerase chain reaction panel for detecting neurologic pathogens in dogs with meningoencephalitis

Meningoencephalitis (ME) is a common inflammatory disorder of the central nervous system in dogs. Clinically, ME has both infectious and non-infectious causes. In the present study, a multiplex quantitative real-time polymerase chain reaction (mqPCR) panel was optimized for the detection of eight canine neurologic pathogens (Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus spp., Neospora caninum, Borrelia burgdorferi, Bartonella spp., Toxoplasma gondii, Ehrlichia canis, and canine distemper virus [CDV]). The mqPCR panel was subsequently applied to 53 cerebrospinal fluid (CSF) samples collected from dogs with ME. The analytic sensitivity (i.e., limit of detection, expressed as molecules per 1 microL of recombinant vector) was 3.8 for CDV, 3.7 for Ehrlichia canis, 3.7 for Bartonella spp., 3.8 for Borrelia burgdorferi, 3.7 for Blastomyces dermatitidis, 3.7 for Cryptococcus spp., 38 for Neospora caninum, and 3.7 for Toxoplasma gondii. Among the tested CSF samples, seven (15%) were positive for the following pathogens in decreasing order of frequency: Cryptococcus spp. (3/7), Blastomyces dermatitidis (2/7), and Borrelia burgdorferi (2/7). In summary, use of an mqPCR panel with high analytic sensitivity as an initial screen for infectious agents in dogs with ME could facilitate the selection of early treatment strategies and improve outcomes.

Assessing bovine babesiosis in Rhipicephalus (Boophilus) microplus ticks and 3 to 9-month-old cattle in the middle Magdalena region, Colombia

Babesia sp. is a protozoan hemoparasite that affects livestock worldwide. The Colombian Middle Magdalena is an enzootic region for babesiosis, but there is no previous research providing detail on its transmission cycle. This study aims to assess some Babesia sp. infection indicators in cattle and ticks from the area, by using direct microscopic and molecular techniques to detect the infection. In the cattle, 59.9% and 3.4 % positivity values for B. bigemina and mixed infection (B. bovis + B. bigemina) were found respectively. In ticks, the positivity of B. bigemina reached 79.2% and 9.4% for the mixed infection. The degree of infestation in the region was 3.2 ticks per bovine. There was positive correlation between tick control acaricide frequencies and infestation in bovines. This leads us to infer that control periodicity greater than 90 days, in stable zones, is an abiotic factor that benefits the acquisition of protective immunity in calves, the natural control of the infection and eventual disease absence. It is necessary to monitor the disease by applying new entomological and parasitological indicators showing the complexity of this phenomenon.

MULTIPLEX SYBR® GREEN-REAL TIME PCR (qPCR) ASSAY FOR THE DETECTION AND DIFFERENTIATION OF Bartonella henselae AND Bartonella clarridgeiae IN CATS / PCR em Tempo Real (qPCR) multiplex utilizando SYBR® Green para a detecção e diferenciação de Bartonella henselae e Bartonella clarridgeiae em gatos

A novel SYBR® green-real time polymerase chain reaction (qPCR) was developed to detect two Bartonella species, B. henselae and B. clarridgeiae, directly from blood samples. The test was used in blood samples obtained from cats living in animal shelters in Southern Brazil. Results were compared with those obtained by conventional PCR targeting Bartonella spp. Among the 47 samples analyzed, eight were positive using the conventional PCR and 12 were positive using qPCR. Importantly, the new qPCR detected the presence of both B. henselae and B. clarridgeiae in two samples. The results show that the qPCR described here may be a reliable tool for the screening and differentiation of two important Bartonella species.

Um novo teste baseado na reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) com SYBR ® Green foi desenvolvido para detectar duas espécies de Bartonella, B. henselae e B. clarridgeiae, diretamente em amostras de sangue. Este teste foi utilizado em amostras de sangue obtidas de gatos que vivem em abrigos de animais do sul do Brasil. Os resultados foram comparados aos obtidos pelo PCR convencional utilizado para a detecção de Bartonella spp. Das 47 amostras analisadas, oito foram positivas no PCR convencional e 12 foram positivas para qPCR. A reação de qPCR, permitiu a detecção da presença simultânea de B. henselae e B. clarridgeiae em duas destas amostras. Os resultados mostram que a qPCR aqui descrita pode ser uma ferramenta confiável para a detecção e diferenciação de duas espécies importantes de Bartonella spp.

Occurrence and characterization of livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in pig industries of northern Thailand

This study was conducted to determine the prevalence of livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus (LA-MRSA) in pigs, farm workers, and the environment in northern Thailand, and to assess LA-MRSA isolate phenotypic characteristics. One hundred and four pig farms were randomly selected from the 21,152 in Chiang Mai and Lamphun provinces in 2012. Nasal and skin swab samples were collected from pigs and farm workers. Environmental swabs (pig stable floor, faucet, and feeder) were also collected. MRSA was identified by conventional bacterial culture technique, with results confirmed by multiplex PCR and multi locus sequence typing (MLST). Herd prevalence of MRSA was 9.61% (10 of 104 farms). Among pigs, workers, and farm environments, prevalence was 0.68% (two of 292 samples), 2.53% (seven of 276 samples), and 1.28% (four of 312 samples), respectively. Thirteen MRSA isolates (seven from workers, four from environmental samples, and two from pigs) were identified as Staphylococcal chromosomal cassette mec IV sequences type 9. Antimicrobial sensitivity tests found 100% of the MRSA isolates resistant to clindamycin, oxytetracycline, and tetracycline, while 100% were susceptible to cloxacillin and vancomycin. All possessed a multidrug-resistant phenotype. This is the first evidence of an LA-MRSA interrelationship among pigs, workers, and the farm environment in Thailand.

Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification assay to detect shiga toxin-producing Escherichia coli in cattle

A multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) assay was developed for simultaneous detection of the stx1 and stx2 genes and applied for detection of shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) in cattle farm samples. Two target genes were distinguished based on T m values of 85.03 +/- 0.54degrees C for stx1 and 87.47 +/- 0.35degrees C for stx2. The mLAMP assay was specific (100% inclusivity and exclusivity), sensitive (with a detection limit as low as 10 fg/microL), and quantifiable (R 2 = 0.9313). The efficacy and sensitivity were measured to evaluate applicability of the mLAMP assay to cattle farm samples. A total of 12 (12/253; 4.7%) and 17 (17/253; 6.7%) STEC O157, and 11 (11/236; 4.7%) non-O157 STEC strains were isolated from cattle farm samples by conventional selective culture, immunomagnetic separation, and PCR-based culture methods, respectively. The coinciding multiplex PCR and mLAMP results for the types of shiga toxin revealed the value of the mLAMP assay in terms of accuracy and rapidity for characterizing shiga toxin genes. Furthermore, the high detection rate of specific genes from enrichment broth samples indicates the potential utility of this assay as a screening method for detecting STEC in cattle farm samples.

Occurrence of Shiga-toxigenic Escherichia coli in Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) / Ocorrência de Escherichia coli Shiga-Toxigênica em Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae)

This study aimed to verify the occurrence of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains in three distinct anatomic parts of the stable fly Stomoxys calcitrans by multiplex polymerase chain reaction (PCR Multiplex). According to the results obtained, E. coli was identified in 19.5% of the stable flies. Shiga toxin genes were detected in 13% of the E. coli isolated, most frequently from the surface, followed by abdominal digestive tract and mouth apparatus of insects, respectively. This is the first study to detect presence of STEC in Stomoxys calcitrans in Brazil; it has also revealed the potential role of stable flies as carriers of pathogenic bacterial agents.

Este estudo teve por objetivo avaliar a ocorrência de Escherichia coli Shiga-Toxigênica (STEC) em três diferentes partes anatômicas da mosca dos estábulos pela Reação de Polimerase em Cadeia Multiplex (PCR Multiplex). De acordo com os resultados obtidos, foi identificada E. coli em 19,5% das moscas dos estábulos colhidas. Foram detectados genes de produção de Shiga toxina em 13,63% das Escherichia coli isoladas, sendo mais frequente a superfície externa, seguido pelo trato digestivo abdominal e pelo aparelho bucal, respectivamente. Este foi o primeiro estudo no Brasil que detectou a presença de STEC em Stomoxys calcitrans e revelou o potencial papel da mosca dos estábulos em carrear um agente bacteriano patogênico.

Detection of virulence-associated genes of Pasteurella multocida isolated from cases of fowl cholera by multiplex-PCR / Pesquisa de genes associados à virulência em cepas de Pasteurella multocida isoladas em casos de cólera aviária através da técnica de multiplex-PCR

The current systems of breeding poultry, based on high population density, increase the risk of spreading pathogens, especially those causing respiratory diseases and those that have more than one host. Fowl Cholera (FC) is one such pathogen, and even though it represents one of several avian diseases that should be considered in the differential diagnosis of notifiable diseases that present with sudden death, the pathogenesis and virulence factors involved in FC are still poorly understood. The objective of this study was to investigate twelve genes related to virulence in 25 samples of Pasteurella multocida isolated from FC cases in the southern region of Brazil through the development of multiplex PCR protocols. The protocols developed were capable of detecting all of the proposed genes. The ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB and nanB genes were present in 100% of the samples (25/25), the sodA and nanH genes were present in 96% (24/25), ptfA was present in 92% (23/25), and pfhA was present in 60% (15/25). Gene toxA was not identified in any of the samples studied (0/25). Five different genetic profiles were obtained, of which P1 (negative to toxA) was the most common. We concluded that the multiplex-PCR protocols could be useful tools for rapid and simultaneous detection of virulence genes. Despite the high frequency of the analyzed genes and the fact that all samples belonged to the same subspecies of P. multocida, five genetic profiles were observed, which should be confirmed in a study with a larger number of samples.

Os atuais sistemas de criação na avicultura, baseados na alta densidade populacional, aumentam os riscos de disseminação de patógenos, especialmente das doenças respiratórias e daquelas cujos agentes etiológicos possuam mais de um hospedeiro. A Cólera Aviária (CA) apresenta estas características e apesar de representar uma das patologias aviárias que deve ser considerada para o diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória que cursam com morte súbita, a patogenia e os fatores de virulência envolvidos na CA ainda estão pouco elucidados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar doze genes associados à virulência em 25 amostras de Pasteurella multocida isoladas de casos de CA na região sul do Brasil através do desenvolvimento de protocolos de multiplex-PCR. Os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos foram capazes de detectar todos os genes propostos. Os genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB estiveram presentes em 100% das amostras (25/25). Os genes sodA e nanH em 96% (24/25), o gene ptfA em 92% (23/25) e o gene pfhA em 60% (15/25). O gene toxA não foi identificado em nenhuma das amostras pesquisadas (0/25). Foram obtidos cinco diferentes perfis genéticos, sendo P1 (negativo para o gene toxA) o mais comum. Com este trabalho, concluiu-se que os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos tornam-se uma ferramenta bastante útil e rápida para a detecção simultânea dos genes de virulência. Apesar da alta frequência dos genes estudados e de todas as amostras pertencerem à mesma subespécie de P. multocida, foram observados cinco perfis genéticos, os quais devem ser confirmados em um estudo com um maior número de amostras.